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二甲双胍在酒精性肝损伤中的保护作用

2013-12-23 10:05:35 来源:中华肝病网 浏览:1738

  二甲双胍在大鼠酒精性肝损伤中的保护作用及其机制

  周东方 周俊英 董荣乔 邢文立

  【关键词】 肝疾病,酒精性; 大鼠; 二甲双胍; 预防和防护用药; 胰岛素抗药性

  酒精性肝病(ALD)的发病与脂质代谢紊乱、肝细胞线粒体内脂肪酸氧化障碍和氧化应激等有关。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)被称为细胞的“代谢感受器”,存在于线粒体内,其信号通路是调节细胞能量状态的中心环节,AMPK激活后可以提高胰岛素敏感性、增加脂肪酸氧化及改善氧化应激。二甲双胍是AMPK的变构激活剂,可以通过调节AMPK、胰岛素受体(INSR)和固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的表达来改善胰岛素抵抗,减轻酒精所致的肝脏损伤。本研究旨在探讨二甲双胍通过改善胰岛素抵抗而预防酒精性肝病的作用机制。

  一、材料与方法

  1.实验动物及试剂:健康雄性清洁级Wistar大鼠,由河北医科大学动物实验中心提供。AMPK-α2羊多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术有限公司;INSR、SREBP兔多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;Taq DNA聚合酶购自北京天根生物科技有限公司;禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶购自美国Promega公司;AMPK、INSR、SREBP、β-肌动蛋白(β-actin)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

  2.研究方法:(1) 动物模型的建立及分组:雄性Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组、模型组及二甲双胍干预组,每组10只。模型组和干预组动物每日上午9时酒精灌胃(30%~60%, 5~9 g·kg-1.d-1),干预组动物每日下午15时二甲双胍水溶液灌胃(80 mg/ml, 200 mg·kg-1.d-1),于16周末分别处死10、8、8只(其中4只因灌胃窒息死亡),留取血清及肝组织标本。

  (2) 检测指标: 空腹血糖应用日本OLYMPUS AU- 600全自动生化分析仪检测。空腹胰岛素测定采用ELISA法,试剂盒购自上海轩昊科技发展有限公司。HOMA法胰岛素抵抗指数(IR) =空腹血糖(mmol/L)×空腹血浆胰岛素(mU/L)/22.5。病理学检查:新鲜肝组织冰冻切片行苏丹Ⅳ染色,余肝组织标本固定于4%中性甲醛中,石蜡包埋,切片,行HE、天狼红染色。免疫组织化学染色法:采用PV法检测AMPK-α2、INSR及SREBP -1c蛋白表达。第一抗体工作浓度:AMPK-α2:1∶100;INSR:1∶200;SREBP-1c:1∶100。RT-PCR法测定AMPK、INSR及SREBP mRNA的表达,引物序列及反应条件。

  3. 统计学方法:用SPSS13.0统计软件处理实验数据,进行多组间方差分析,以均数±标准差(x ± s)表示, P < 0.05为差异有统计学意义,P < 0.01为有显著统计学意义。

  二、结果

  1.大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数改变:模型组空腹血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均高于正常对照组,二甲双胍干预组上述指标明显改善。

  2.肝组织病理变化:正常对照组肝组织肝细胞呈单核多层状,肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射样排列,偶有脂变;模型组大鼠肝细胞弥漫性小泡性脂肪变性,窦周纤维化,汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成,二甲双胍干预组脂变较模型组有所减轻。

  3.免疫组织化学法检测大鼠肝组织AMPK、INSR、SREBP蛋白的表达:模型组AMPK和INSR表达较正常对照组减少而SREBP表达增强,二甲双胍干预组上述变化明显改善。

  4. RT-PCR法检测AMPK、INSR、SREBPmRNA的表达:与正常组比较,模型组AMPK、INSR mRNA表达减少,SREBP mRNA表达增加,差异有统计学意义;干预组各项指标较模型组均有所改善,差异有统计学意义。

  三、讨论

  AMPK存在于线粒体内,属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员,发生磷酸化修饰后可促进ATP合成,并抑制ATP分解,在增加脂肪酸氧化、胰岛素敏感性及氧化应激等方面发挥重要作用。AMPK的活性主要受细胞中AMP/ATP比值的调节,其发生磷酸化并激活下游的多种靶分子,SREBP作为AMPK 的下游基因,是一类位于内质网和核被膜上的膜连接蛋白,是参与脂肪合成基因的主要转录调节因子,主要在肝脏和脂肪细胞表达,AMPK活化后抑制SREBP靶基因的表达,因此AMPK可能在调节脂肪酸和胆固醇代谢中发挥着重要作用。

  AMPK 172位点苏氨酸的磷酸化状态具有高效的催化活性,乙醇可以通过多种途径抑制AMPK(Thr172)磷酸化修饰[5]。SREBP可激活脂肪酸合成酶及其他脂质代谢相关基因的转录、增加胆固醇及游离脂肪酸、促进肝内脂肪合成。游离脂肪酸水平升高可引起脂肪异位沉积于胰岛素敏感组织(肝脏、肌肉及脂肪组织),干扰胰岛素信号转导通路中胰岛素受体及胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化,影响磷脂酰肌醇3激酶的激活,影响胰岛素信号通路的正常转导,进而导致胰岛素抵抗。AMPK可通过抑制SREBP靶基因的表达,减少脂肪酸和胆固醇的合成,从而改善胰岛素抵抗。本研究结果显示模型组大鼠空腹血糖、血浆胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数升高,肝组织胰岛素受体表达减少,提示模型组出现胰岛素抵抗。胰岛素抵抗被认为是多个疾病发病机制的中心环节之一,大量流行病学调查发现健康人群长期、过量饮酒会增加胰岛素抵抗的发生。胰岛素抵抗现象随酒精性肝损伤的加重明显增加。乙醇通过引起胰岛素受体数目减少及亲和力障碍、磷脂酰肌醇3激酶信号通路异常等造成胰岛素抵抗、氧化应激增加和脂质过氧化等,并降低胰岛素敏感性。

  二甲双胍作为一种广泛应用于治疗糖尿病的药物,可降低葡萄糖在肠道的吸收,抑制肝糖原异生及高血糖素释放等,此外二甲双胍可降低血浆游离脂肪酸和三酰甘油水平。Zhou等在SD大鼠原代肝脏细胞中发现二甲双胍通过增加AMPK的磷酸化,抑制乙酰辅酶A的活性,并减少细胞中脂肪酸合成酶和SREBP-1的表达,从而抑制脂肪酸和极低密度脂蛋白的合成,并使得肝脏中游离脂肪酸氧化增加。Hardie等研究发现二甲双胍激活AMPK的分子机制与AMPKα2的172位点苏氨酸磷酸化增加有关。经二甲双胍处理后,大鼠肝细胞中乙酰辅酶A羧化酶活性降低,SREBP-1 mRNA和蛋白质的表达被抑制,肝糖原输出被抑制,同时AMPK活性增强。

  本研究显示模型组肝组织AMPK表达减少而SREBP的表达逐渐增加,二甲双胍干预组肝组织病变减轻,胰岛素抵抗指数降低,肝组织胰岛素受体表达增加,SREBP表达减少,结果表明二甲双胍通过改善胰岛素抵抗来发挥预防酒精性肝病的作用。

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